S24-P01-C04 Tests génétiques

S24-P01-C04 Tests génétiques

S24

Génétique et maladies métaboliques

Alain Verloes et Brigitte Chabrol

Chapitre S24-P01-C04

Tests génétiques

Alain Verloes

Détection des variants de petite taille

Il n’entre pas dans les objectifs de ce chapitre de décrire en détail les techniques de laboratoire nécessaires à l’analyse de l’ADN à but diagnostique, mais seulement de passer en revue quelques données générales. D’un point de vue très pratique, rappelons ici que la culture de lymphocytes requiert du sang prélevé sur tube hépariné. Toutes les technologies basées sur l’étude de l’ADN (séquençage, analyse chromosomique sur puce ADN [ACPA]) se font à partir de sang prélevé sur tube anti coagulé à l’EDTA (éthylènediaminetétraacétique). La récolte de l’ARN requiert des tubes spécifiques (par exemple : tubes PAXgene® qui assurent sa stabilité).

Amplification de l’ADN par PCR

La réaction en chaîne de la polymérase, ou PCR, est une technique d’amplification d’un fragment d’ADN délimité par deux oligonucléotides synthétiques (appelés amorces) complémentaires des bornes du segment que l’on veut étudier. Plusieurs cycles de synthèse/dénaturation de l’ADN permettent d’amplifier spécifiquement le segment d’ADN délimité par les deux amorces. La quantité d’ADN nécessaire peut être très réduite : dans le cadre du diagnostic pré-implantatoire, la PCR est faite à partir de l’ADN d’une seule cellule ! Le fragment amplifié peut être analysé par diverses techniques ou servir lui-même de sonde. Des artifices techniques permettent de réaliser simultanément plusieurs PCR en parallèle (PCR multiplex). La sensibilité des techniques de PCR les rend très sensibles aux contaminations par les ADN exogènes. Des raffinements méthodologiques permettent d’utiliser les techniques de PCR de façon quantitative (qPCR) : en comparant la quantité d’ADN générée en parallèle pour plusieurs cibles, on peut déduire le nombre de copies d’une séquence d’intérêt dans un génome. La qPCR est notamment utilisée en routine pour vérifier l’existence de CNV (copy number variant) détectés par ACPA.

Certaines techniques de détection de mutations font appel à la PCR. Ainsi, on peut réaliser en parallèle deux PCR en positionnant l’une des amorces au niveau d’une mutation récurrente. L’une des PCR utilise une amorce complémentaire de la séquence sauvage, l’autre de la séquence mutée. Si le sujet est homozygote normal, la PCR utilisant l’amorce complémentaire de la mutation échouera ; s’il est homozygote muté, seules les amorces complémenta…

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